丁酸梭菌的分離鑒定及益生特性

時間:2020-08-30    點擊:47

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丁酸梭菌的基本特征

    丁酸梭菌菌落為灰白色,中間隆起呈煎蛋樣,菌體單個生或對生,呈直桿狀或者稍微彎曲的短鏈結構,周邊具有運動性的鞭毛。丁酸梭菌最適 pH值為4.09.8,最適溫度為2537 ℃。另外,丁酸梭菌在室外具有良好的穩定性,對多種抗生素都具有很強的耐藥性,但是對少數新生霉素、四環素、萬古霉素等比較敏感。丁酸梭菌能分泌淀粉酶和發酵多種糖類產酸。根據《伯杰細菌鑒定手冊》,丁酸梭狀芽孢桿菌為嚴格厭氧菌,菌株在培養過程中可產酸產氣,內生孢子為卵圓形到球形,偏心或次端生。

圖1 菌落形態及革蘭氏染色顯微鏡下觀察照片


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丁酸梭菌的分離鑒定

2.1 主要培養基:

    梭菌選擇培養基(TSN培養基),用于丁酸梭菌的分離培養,其配方為:胰蛋白胨17  g/L、大豆蛋白胨3 g/L、氯化鈉5 g/L、磷酸二氫鉀2.5 g/L和葡萄糖2.5 g/L

    梭菌增殖培養基(RCM培養基),用于丁酸梭菌的純培養,其配方為:酵母浸粉3g/L、牛肉膏10 g/L、蛋白胨10 g/L、可溶性淀粉1 g/L、葡萄糖5 g/L、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、氯化鈉3 g/L和乙酸鈉3 g/L

          LB培養基由胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L和氯化鈉10 g/L組成;

    普通肉湯培養基由蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L和氯化鈉5 g/L組成。

    上述各培養基分別加入2%瓊脂即可配成固體培養基。

2.2  分離鑒定

   (1)無菌稱取樣品放入無菌生理鹽水中溶解;

   (2)用生理鹽水進行10倍梯度稀釋;

   (3)分別稀釋涂布于TSN培養基中置于37℃恒溫培養箱中靜置厭氧培養48h,觀察菌落形態特征。

   (4)對可疑菌落進行革蘭氏染色,用顯微鏡油鏡觀察不同菌落的菌體特征和染色特性。

   (5)選取符合丁酸梭菌形態特征的菌落劃線接種RCM培養基繼續培養,直到得到可疑菌落的純培養物。

   (6)進行生理生化檢測以及16SrDNA鑒定

    生理生化參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對可疑菌落的純培養物進行生理生化鑒定。鑒定項目包括硝酸鹽還原、明膠液化、吲哚、硫化氫產生以及蜜二糖、松三糖和淀粉的發酵。

    鑒定結果:對該分離株進行硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、糖發酵等試驗,其鑒定結果如表1。從生化反應結果來看,該菌株的特征與丁酸梭菌是一致的,初步鑒定該分離株為丁酸梭菌。

提取丁酸梭菌分離株的基因組,以其為模板進行1616SrDNA的PCR擴增,擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后結果見圖2,可見一條大小為1500 bp左右的特異性條帶,與預期條帶大小相符。將目的條帶進行膠回收純化和核苷酸測序,并將測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對,結果表明,該菌株的1616SrDNA基因序列與丁酸梭菌(NCBI登錄號:KC196777.1)同源性達100%,因此確定該分離株為梭菌屬丁酸梭菌。



 


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丁酸梭菌的益生特性

3.1 丁酸梭菌的抑制致病菌能力

    丁酸梭菌培養上清液抑制致病菌能力的結果見表2和表3。其中表2為牛津杯法測定的試結果,對照組是RCM培養液,其抑菌圈直徑為0mm,對致病菌無抑制作用,而丁酸梭菌培養上清液作用大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌后,抑菌圈直徑分別為25.0、26.3、28.4mm。由此可知,丁酸梭菌培養上清對這3種致病菌均有良好的抑制作用,其中對鼠傷寒沙門氏菌的抑制作用最強。

活菌計數法試驗結果見表3。丁酸梭菌培養上清液作用大腸桿菌5、15、30、60min后抑菌力分別提高了53.33%、56.67%、68.33%、78.33%;丁酸梭菌培養上清液作用豬霍亂沙門氏菌5、15、30、60min后抑菌力分別提高了56.67%、60.33%/69.67%、78.67%;丁酸梭菌培養上清液作用鼠傷寒沙門氏菌5、15、30、60min后抑菌力分別提高了59.67%、61.33%、70.33%、83.33%,并且隨著丁酸梭菌培養上清液作用時間的延長對這3種致病菌的抑制作用均有所增強。由此可見,牛津杯法和活菌計數法測定丁酸梭菌抑菌能力的試驗結果是一致的。試驗數據表明,丁酸梭菌能夠有效抑制3種致病菌的生長,抑制作用由強到弱依次為鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和大腸桿菌。

3.2 丁酸梭菌對IPEC-J2(豬小腸上皮細胞)生長的影響

 

    用不同劑量的丁酸梭菌處理IPEC-J2細胞3h,顯微鏡下觀察細胞生長狀況,當MOI(MOI=細菌數量/細胞數 量)為0、1、10和50時細胞生長狀況均良好,表現為細胞透明度大、折光性強、輪廓不清,當MOI為100時,細胞折光性降低、輪廓增強、細胞之間空隙增大、細胞形態不規則,少量細胞甚至死亡,漂浮在細胞培養液中。由此可見,MOI為1、10和50時丁酸梭菌對細胞的正常生長無可見影響,當MOI為100時,丁酸梭菌會影響細胞的正常生長,造成細胞損傷甚至死亡。

3.3 丁酸梭菌黏附IPEC-J2的能力 

由表4可知,與丁酸梭菌作用細胞3h相比,丁酸梭菌作用細胞6、12h,其黏附指數分別增加4.9%、4.0%,丁酸梭菌作用24h時,黏附指數降低了1.8%,無顯著差異(p>0.05),其中作用時長為6h時丁酸梭菌黏附細胞的數量最多,說明丁酸梭菌對豬腸上皮細胞具有很好的黏附性。

由表5可知,與MOI為1相比,MOI為10、50、100時,丁酸核菌的黏附能力均顯著增加(P<0.05),且以MOI為50時丁酸梭菌的黏附能力最強。顯微觀察發現,MOI為100時,較多的細胞形態發生了改變,并伴有部分細胞漂浮于培養液中,因此,丁酸梭菌處理濃度MOI為100時對細胞具有損傷作用。


3.3丁酸梭菌對致病菌黏附IPEC-J2的影響

    由表6可知,與大腸桿菌刺激細胞0h相比,大腸桿菌刺激細胞3、6、12和24 h時,其黏附數分別降低了11%、36%、43%和25%;與豬霍亂沙門氏菌刺激細胞0h相比,豬霍亂沙門氏菌刺激細胞3、6、12和24 h時,其黏附數分別降低了25%、40%、50%和17%;與鼠傷寒沙門氏菌刺激細胞0h相比,鼠傷寒沙門氏菌刺激細胞3、6、12和24 h時,其黏附數分別降低了35%、47%、55%和16%;并且3種致病菌均以作用細胞12h時其黏附數降低為最多。試驗數據表明,丁酸梭菌能夠有效抑制3種致病菌黏附IPEC-J2,其抑制效果由強到弱依次是鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌。

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實驗結論

    從健康斷奶仔豬糞便中成功分離到一株丁酸梭菌,該分離株能夠顯著抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌的生長,能夠黏附IPEC-J2且能抑制致病性大腸桿菌和沙門氏菌的黏附。





文章節選自《中國畜牧獸醫》2020,v.47(01):274-282.

作者:王倩,李海花,竇彩霞,等.一株丁酸梭菌的分離鑒定及其益生特性研究[J].


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